精準檢測疾病SV—PacBio SMRT技高一籌
2019.03.12

目前二代測序廣泛應用于人基因組測序以檢測疾病SNP、Indel等,但傳統的二代測序不能滿足高GC和重復序列區域測序的準確性,導致無法檢測到很多引起疾病的大片段結構變異和多態性位點。PacBio三代單分子實時測序技術以其超長讀長、無GC偏好性、覆蓋度均一等優勢可輕松獲取人基因組高GC和重復序列區域的信息,可全面挖掘基因組的大片段結構變異信息,對臨床疾病診斷和治療具有重要意義。下面通過2篇案例帶大家深入了解一下PacBio SMRT測序在臨床疾病SV研究中的應用~


PacBio人基因組重測序發現Carney綜合癥相關結構變異[1]

發表期刊

Genetics in medicine


影響因子

9.937


材料選擇

Carney綜合征患者


測序策略

約8.6X低深度人重測序


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圖1 研究思路圖


本文的研究對象為在成長過程中表現出疑似Carney綜合征表型的患者(Carney綜合征是由粘液瘤、皮膚色素沉著、內分泌功能亢進所組成的常染色體顯性遺傳綜合征),先進行Illumina二代測序未檢測到任何與臨床表型相關的致病變異,因此使用PacBio低覆蓋度(8.6X)全基因組測序來檢測結構變異SV,共發現了6,971個缺失和6,821個50bp以上的插入變異。通過與陰性對照對比,并與Refseq基因外顯子和蛋白質編碼序列比對,側重分析疾病相關基因的外顯子區域,篩選出55個SV,其中有6個SV(3個缺失,3個插入)在OMIM(人類基因和遺傳表型關聯的綜合性數據庫 )中與遺傳疾病相關。


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圖2 PacBio測序發現PRKAR1A基因中的雜合缺失


通過分析表型相關性,發現最佳候選變異為一段2,184bp的雜合缺失,該變異覆蓋PRKAR1A編碼基因的第一個外顯子,PRKAR1A基因為抑癌基因,其突變可能與內分泌腫瘤的發生有關,可導致Carney綜合征。Sanger測序結果也發現此缺失突變的存在,并且證實了PacBio可以精確檢測出缺失斷裂點。


PacBio人基因組重測序發現癲癇相關結構變異[2]

發表期刊

Journal of human genetics


影響因子

2.942


材料選擇

癲癇患者


測序策略

6-13X低深度人重測序


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圖3 研究思路圖


本文研究了一個患有進行性肌陣攣性癲癇的家庭,其中兩個患病姐弟表現出類似的臨床上的破壞性神經退行性表型,先進行了全外顯子組測序但沒有發現致病變異,因此進行了PacBio長讀長測序,使用低覆蓋度(6X)全基因組測序檢測結構變異SV,發現17,165個SV(7,216個缺失和9,949個插入)。通過與陰性對照對比,并與Refseq基因外顯子和蛋白質編碼序列比對,側重分析疾病相關基因的外顯子區域,篩選出50個SV,其中有5個SV(2個缺失,3個插入)在OMIM中與遺傳疾病相關,存在于常染色體隱性表型相關基因上。


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圖4 候選SV篩選


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圖5 PacBio測序發現CLN6基因中的缺失變異


其中,PacBio測序結果顯示CLN6基因上一個12.4kb的缺失變異,跨越其第一個編碼外顯子,是最佳候選變異,因CLN6雙等位基因突變會導致常染色體隱性癲癇,與患病姐弟的臨床特征相符。該缺失包括起始密碼子,存在于含有多個重復區域的高GC區。這些結果表明PacBio長讀長全基因組測序可以發現全外顯子測序難以檢測到的變異信息。


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圖6 CLN6缺失變異家系圖譜


通過RT-PCR證實了患者及其親本分別為純合和雜合缺失,Southern印跡分析驗證了PacBio測序發現的缺失片段的大小和位置,結合Sanger測序證實了缺失片段兩側的Alu元件,提示Alu-Alu介導的重組(AAMR),可能是導致此長片段缺失的機制。

 

這兩篇文章充分表明即使低深度的PacBio SMRT測序也能夠對全基因組范圍內的結構變異進行有效檢出,尤其是對于二代測序不能有效覆蓋的高GC區域和重復序列區域,PacBio SMRT測序可以通過超長讀長、無GC偏好性、覆蓋度均一的優勢對這些區域進行有效覆蓋。當前在醫學領域越來越多的科研文獻使用PacBio SMRT測序技術來解析人類疾病。隨著PacBio最近一次V3.0版本試劑升級以及即將到來的8M測序芯片,未來必然會大大拓展PacBio SMRT測序在人類基因組檢測領域的應用,發揮其潛在臨床效用。


目前安諾基因PacBio三代人基因組重測序,可對大片段基因組結構變異進行檢測、過濾和注釋,通過可視化的方法描繪基因組變異圖譜。同時研發的高級分析,可基于標準分析獲得的各類基因組變異信息,進行罕見變異分析、新生變異分析、顯性/隱性遺傳模式分析、復合雜合遺傳模式分析以及靶向藥物反應分析等,助力深入研究核心家系遺傳病、罕見病、腫瘤成對樣本等。如有任何需求和問題歡迎您隨時留言咨詢~


參考文獻

[1] Merker JD, Wenger AM, Sneddon T, et al. Long-read genome sequencing identifies causal structural variation in a Mendelian disease[J]. 2018, Genet Med, .01.20

[2] Mizuguchi T, Suzuki T, Abe C, et al. A 12-kbstructural variation in progressive myoclonic epilepsy was newly identified bylong-read whole-genome sequencing[J]. 2019, J HumGenet, 02.13

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